Pengklonan gen adalah tindakan membuat salinan, atau klon, gen tunggal. Sebaik sahaja gen dikenal, klon boleh digunakan dalam banyak bidang penyelidikan bioperubatan dan perindustrian. Kejuruteraan genetik adalah proses kloning gen ke organisma baru atau mengubah urutan DNA untuk mengubah produk protein. Kejuruteraan genetik bergantung kepada keupayaan kami untuk melaksanakan prosedur penting berikut.
Reaksi Rantaian Polimerase
02 Enzim Sekatan
Penemuan enzim yang dikenali sebagai endonukleases larangan telah menjadi penting untuk kejuruteraan protein . Enzim-enzim ini memotong DNA di lokasi spesifik berdasarkan urutan nukleotida. Beratus-ratus enzim sekatan yang berlainan, yang mampu memotong DNA di tapak yang berbeza, telah diasingkan dari pelbagai jenis bakteria. Potongan DNA dengan enzim sekatan menghasilkan banyak serpihan yang lebih kecil, dengan pelbagai saiz. Ini boleh dipisahkan menggunakan elektroforesis gel atau kromatografi.
03 Elektroforesis
Memurnikan DNA dari budaya sel, atau memotongnya menggunakan enzim sekatan tidak akan banyak digunakan jika kita tidak dapat memvisualkan DNA - iaitu, mencari cara untuk melihat sama ada ekstrak anda mengandungi apa-apa, atau apa saiz serpihan anda telah memotongnya. Satu cara untuk melakukan ini adalah dengan elektroforesis gel. Gel digunakan untuk pelbagai tujuan, dari melihat memotong DNA untuk mengesan kemasukan DNA dan knockouts.
04 Sertai Dua Potongan DNA
Dalam penyelidikan genetik, seringkali diperlukan untuk menghubungkan dua atau lebih helai DNA individu, untuk membuat sehelai rekombinan, atau menutup sehelai lingkaran yang telah dipotong dengan enzim sekatan. Enzim yang dipanggil ligase DNA boleh mewujudkan ikatan kovalen antara rangkaian nukleotida. Enzim DNA polimerase I dan polynucleotide kinase juga penting dalam proses ini, untuk mengisi jurang atau fosforilasi 5 'ujung, masing-masing.
05 Pemilihan DNA Meniru Diri Kecil
Kepingan kecil bulat DNA yang bukan sebahagian daripada genom bakteria, tetapi mampu replikasi diri, dikenali sebagai plasmid. Plasmids sering digunakan sebagai vektor untuk mengangkut gen antara mikroorganisma. Dalam bioteknologi, sekali gen minat telah diperkuatkan dan kedua-dua gen dan plasmid dipotong oleh enzim sekatan, mereka disatukan bersama menghasilkan apa yang dikenali sebagai DNA rekombinan. Viral (bacteriophage) DNA juga boleh digunakan sebagai vektor, seperti yang boleh kosmid, plasmid rekombinan mengandungi gen bacteriophage.
06 Kaedah untuk Memindahkan Vektor Ke Cell Host
Proses pemindahan bahan genetik pada vektor seperti plasmid, ke dalam sel-sel tuan rumah baru, dipanggil transformasi. Teknik ini memerlukan sel-sel tuan rumah terdedah kepada perubahan alam sekitar yang menjadikannya "kompeten" atau sementara yang dapat ditebang ke vektor. Electroporation adalah satu teknik sedemikian. Semakin besar plasmid, semakin rendah kecekapan yang mana ia diambil oleh sel-sel. Segmen DNA yang lebih besar lebih mudah diklonkan menggunakan bakteroid, retrovirus atau vektor virus lain atau kosmid dalam kaedah yang dipanggil transduction. Phage atau vektor virus sering digunakan dalam ubat regeneratif tetapi boleh menyebabkan penyisipan DNA di bahagian kromosom kita di mana kita tidak mahu, menyebabkan komplikasi dan juga kanser.
07 Kaedah untuk Memilih Organisme Transgenik
Tidak semua sel akan mengambil DNA semasa transformasi. Adalah penting bahawa terdapat kaedah untuk mengesan yang dilakukan. Secara umum, plasmid membawa gen untuk penentangan antibiotik dan sel-sel transgenik boleh dipilih berdasarkan ekspresi gen-gen tersebut dan keupayaannya untuk tumbuh pada media yang mengandung antibiotik itu. Kaedah pemilihan alternatif bergantung kepada kehadiran protein reporter lain seperti sistem x-gal / lacZ , atau protein pendarfluor hijau, yang membolehkan pemilihan berdasarkan warna dan pendarfluor, masing-masing.