Apa yang PCR Perlu Dilakukan Dengan DNA Sequencing dan Gen Mengubah
Reaksi rantai polimerase ( PCR ) adalah teknik genetik molekul untuk membuat beberapa salinan gen dan juga merupakan sebahagian daripada proses penjujukan gen.
Bagaimana Reaksi Rantaian Polimerase Beroperasi?
Salinan gen dibuat menggunakan sampel DNA, dan teknologi itu cukup baik untuk membuat beberapa salinan dari satu salinan gen yang terdapat di dalam sampel. Penguatan PCR gen untuk membuat jutaan salinan, membolehkan pengesanan dan pengenalan urutan gen menggunakan teknik visual berdasarkan ukuran dan caj (+ atau -) sekeping DNA.
Di bawah keadaan terkawal, segmen kecil DNA dijana oleh enzim yang dikenali sebagai DNA polimerase, yang menambah deoxynucleotides percuma (dNTPs) ke sekeping DNA yang dikenali sebagai "templat." Bahkan lebih kecil DNA, disebut "primers" digunakan sebagai titik permulaan untuk polimerase. Primer adalah kecil buatan manusia DNA (oligomer), biasanya antara 15 dan 30 nukleotida panjang. Mereka dibuat dengan mengetahui atau meneka urutan DNA pendek di hujung gen yang diperkuatkan. Semasa PCR, DNA yang disusun dipanaskan dan kedua-dua helai berganda. Apabila penyejukan, primers mengikat kepada template (dipanggil penyepuhlindapan) dan membuat tempat untuk polimerase untuk bermula.
Teknik PCR
Reaksi rantai polimerase (PCR) telah dibuat dengan penemuan enzim polimerase termofil dan thermophilic (enzim yang mengekalkan integriti struktur dan fungsi selepas pemanasan pada suhu tinggi).
Langkah-langkah yang terlibat dalam teknik PCR adalah seperti berikut:
- Campuran dibuat, dengan penumpuan optimum dari templat DNA, enzim polimerase, primer, dan dNTP. Keupayaan untuk memanaskan campuran tanpa mensimulasikan enzim membolehkan denial ganda sampel DNA pada suhu dalam lingkungan 94 darjah Celsius.
- Setelah denaturation, sampel disejukkan ke julat yang lebih sederhana, sekitar 54 darjah, yang memudahkan penyepuhlindiran (mengikat) primers ke templat DNA terkandas tunggal.
- Dalam langkah ketiga kitaran, sampel dipanaskan semula kepada 72 darjah, suhu ideal untuk Taq DNA Polymerase, untuk pemanjangan. Semasa pemanjangan, polimerase DNA menggunakan helai tunggal asal DNA sebagai templat untuk menambahkan dNTPs pelengkap ke hujung 3 'setiap helai dan menghasilkan satu bahagian DNA double-stranded di kawasan gen yang menarik.
- Primer yang telah disebarkan kepada urutan DNA yang bukan perlawanan tepat tidak tetap disebarkan pada 72 derajat, dengan itu mengehadkan pemanjangan kepada gen yang menarik.
Proses denatur, penyepuhlindapan dan pemanjangan ini diulangi berganda (30-40) kali, dengan demikian meningkatkan jumlah eksponen bilangan gen yang dikehendaki dalam campuran. Walaupun proses ini agak membosankan jika dilakukan secara manual, sampel boleh disediakan dan diinkubasikan dalam Thermocycler yang boleh diprogramkan, kini menjadi biasa di kebanyakan makmal molekul, dan tindak balas PCR yang lengkap dapat dilakukan dalam 3-4 jam.
Setiap langkah penentangan menghentikan proses pemanjangan kitaran terdahulu, sehingga memangkas sehelai DNA baru dan mengekalkannya pada kira-kira saiz gen yang dikehendaki.
Tempoh kitaran pemanjangan boleh dibuat lebih lama atau lebih pendek bergantung kepada saiz gen yang menarik, tetapi akhirnya, melalui kitaran PCR yang berulang, majoriti templat akan terhad kepada saiz gen yang menarik sahaja, kerana akan dihasilkan daripada produk kedua-dua primer.
Terdapat beberapa faktor yang berbeza untuk PCR yang berjaya dapat dimanipulasi untuk meningkatkan hasilnya. Kaedah yang paling banyak digunakan untuk menguji kehadiran produk PCR ialah elektroforesis gel agarosa . Yang digunakan untuk memisahkan serpihan DNA berdasarkan ukuran dan caj. Serpihan kemudiannya divisualisasikan menggunakan pewarna atau radioisotop.
Evolusi
Sejak penemuan PCR, polimerase DNA selain Taq yang asal telah ditemui. Sesetengahnya mempunyai kebolehan "proofreading" yang lebih baik atau lebih stabil pada suhu yang lebih tinggi, sekali gus meningkatkan kekhususan PCR dan mengurangkan ralat daripada pemasukan dNTP yang salah.
Beberapa variasi PCR telah direka untuk aplikasi spesifik dan kini digunakan secara tetap dalam makmal genetik molekul. Sebahagian daripada ini adalah PCR Masa Nyata dan PCR Reverse-Transcriptase. Penemuan PCR juga membawa kepada pembangunan penjujukan DNA , cap jari DNA dan teknik molekul lain.