Pelarasan kepada mana-mana komponen tindak balas Reaksi Rantai Polimerase (PCR) dapat mengubah kualiti hasil, sama ada dengan meningkatkan atau mengurangkan hasil dan kualiti produk atau dengan meningkatkan kekhususan dan kepekaan reaksi. Parameter yang mempengaruhi keputusan akhir boleh sama ada fizikal (iaitu, suhu, masa kitaran) atau kimia (iaitu, tumpuan template, jenis enzim yang digunakan). Berikut adalah beberapa faktor utama yang mempengaruhi kejayaan PCR.
01 Keadaan Makmal Bersih
Oleh kerana PCR mampu mengesan satu molekul DNA, penting untuk mengekalkan keadaan murni di makmal. Sentiasa memakai sarung tangan segar, gunakan gelas steril, tiub dan tips pipet dan penyelesaian steril, dan bersihkan kawasan kerja sebelum memulakan kerja.
Sentiasa masukkan tindak balas kawalan, tanpa DNA template dan tanpa enzim, untuk memastikan hasilnya benar-benar disebabkan oleh penguatan sampel yang betul.
Kebanyakan orang pasti mempunyai set penyelesaian sendiri yang tidak dikongsi untuk membuat penyelesaian masalah lebih mudah dan pipet yang ditetapkan sering diketepikan untuk PCR sahaja. Tiub PCR bebas DNase dan RNase, tips pipet tahan aerosol dan bekerja di hud fume dengan cahaya UV juga cara untuk meminimumkan masalah.
02 Komponen Kimia
- Mempunyai 18 hingga 24 pangkalan
- Tidak mempunyai struktur sekunder (iaitu, gelung rambut)
- Mempunyai pengagihan seimbang G / C dan A / T pasangan
- Tidak saling melengkapi di hujung 3 kaki
- Suhu lebur (Tm) kira-kira 5-10 darjah Celcius di bawah suhu penyepuhlindapan, yang biasanya antara 55 dan 65 darjah Celsius
Tm untuk kedua-dua primer juga harus sama untuk hasil terbaik.
03 Reaksi Campuran: Templat dan Primer
Kepekatan primer optimum adalah antara 0.1 dan 0.6 mikromol / L. Jumlah template berbeza bergantung kepada jenis DNA (manusia, bakteria, plasmid).
Dengan jumlah templat yang sangat rendah, terdapat strategi lain untuk meningkatkan hasil, seperti peningkatan bilangan kitaran atau penggunaan "permulaan panas." Selalu menguji primer baru dengan reaksi kawalan positif, untuk memastikan mereka bekerja di bawah keadaan eksperimen tertentu anda.
04 Reaksi Campuran: Aktiviti Enzim
Kepekatan MgCl2 dalam campuran tindak balas boleh mempengaruhi hasil PCR dan boleh memainkan peranan penting dalam tindak balas yang lebih pantas. Kation magnesium membentuk kompleks larut dengan dNTP untuk menghasilkan substrat sebenar yang dikenalpasti enzim polimerase.
Jumlah kesemua empat dNTP juga membantu mengurangkan kadar ralat polimerase. Sesetengah aditif seperti betaine, BSA, deterjen, DMSO, gliserol, dan pyrophosphatase juga boleh mempengaruhi kekhususan enzim atau kecekapan reaksi.
05 Jenis Thermocycler
Apabila membeli peralatan makmal, ingatlah bahawa beberapa termoskopi kurang tepat daripada yang lain dalam mengekalkan suhu yang tepat dan dikehendaki.
Ini adalah salah satu bidang di mana murah tidak akan dibayar dalam jangka panjang apabila anda berhadapan dengan tindak balas yang halus atau menggunakan primers yang memerlukan suhu sempit penyepuh.
Tiub reaksi berdinding nipis direka untuk memenuhi jenama termokisin yang tepat yang anda gunakan, juga membantu mengoptimumkan suhu tindak balas.
06 Tetapan Kitaran
Peningkatan hasil dapat dicapai dengan meningkatkan masa perpanjangan kira-kira setiap 20 kitaran, untuk mengimbangi kurang enzim untuk memperkuat lebih banyak templat. Selalunya, kurang daripada 40 kitaran cukup untuk menguatkan kurang daripada 10 molekul templat kepada kepekatan yang cukup besar untuk dilihat pada gel agarose bernama etidium bromida.